人偏肺病毒q-pcr檢測方法

博禾醫(yī)生
人偏肺病毒的q-pcr檢測主要通過核酸提取、引物探針設(shè)計、擴增反應(yīng)、結(jié)果分析和質(zhì)控驗證五個步驟完成。
采用磁珠法或離心柱法從呼吸道樣本中提取病毒RNA,樣本類型包括鼻咽拭子、肺泡灌洗液等。提取過程需在生物安全柜內(nèi)操作,防止氣溶膠污染,同時加入內(nèi)參基因監(jiān)控提取效率。提取后的RNA需立即逆轉(zhuǎn)錄或保存于零下80度環(huán)境。
針對病毒N基因或L基因保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和TaqMan探針。引物長度通常為18-22個堿基,Tm值控制在58-60度,探針5'端標記FAM熒光基團,3'端淬滅基團多選用BHQ1。需通過BLAST驗證序列特異性,避免與其他呼吸道病毒交叉反應(yīng)。
采用一步法RT-qPCR體系,包含逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、dNTPs和緩沖液。反應(yīng)程序設(shè)置為50度逆轉(zhuǎn)錄15分鐘,95度預(yù)變性3分鐘后,進行45個循環(huán)的95度15秒、60度1分鐘兩步擴增。每批檢測需設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。
根據(jù)擴增曲線Ct值判定結(jié)果,通常Ct值≤37為陽性,37-40需重復(fù)檢測,>40為陰性。采用標準品制作標準曲線進行定量分析,擴增效率應(yīng)保持在90-110%之間。需注意曲線形態(tài)判斷,排除非特異性擴增或抑制現(xiàn)象。
實驗室需定期參加室間質(zhì)評,每批次檢測需監(jiān)控內(nèi)參基因Ct值穩(wěn)定性。提取環(huán)節(jié)加入過程控制品,擴增體系加入內(nèi)標檢測抑制物。陽性樣本建議進行基因測序驗證,新引物探針需通過靈敏度與特異性驗證,檢測下限需達到100拷貝/毫升。
檢測前24小時避免劇烈運動及高脂飲食,采樣時使用無菌聚酯纖維拭子深入鼻咽部旋轉(zhuǎn)停留10秒,采樣后2小時內(nèi)送檢。實驗室應(yīng)分區(qū)操作避免污染,定期校準熒光定量PCR儀,操作人員需穿戴防護裝備。冬季流行季節(jié)可增加檢測頻次,免疫功能低下者出現(xiàn)陰性結(jié)果時建議復(fù)測或聯(lián)合血清學檢查。
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