蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑發(fā)生什么反應(yīng)
蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑反應(yīng)呈現(xiàn)紫色，這一現(xiàn)象基于肽鍵與堿性銅離子的絡(luò)合作用，常用于生物化學(xué)檢測(cè)。反應(yīng)原理涉及蛋白質(zhì)肽鍵在堿性條件下與Cu2?形成紫色絡(luò)合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。
1. 反應(yīng)原理
雙縮脲試劑由氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉和硫酸銅組成。堿性環(huán)境使蛋白質(zhì)肽鍵（-CO-NH-）解離，氮原子孤對(duì)電子與Cu2?配位形成四齒螯合物。該絡(luò)合物在540nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，紫色深淺直接反映肽鍵數(shù)量。反應(yīng)特異性針對(duì)含兩個(gè)以上肽鍵的化合物，單氨基酸無(wú)此反應(yīng)。
2. 檢測(cè)應(yīng)用
臨床生化檢驗(yàn)常用該方法測(cè)定血清總蛋白，正常參考范圍60-80g/L。操作時(shí)將試劑與樣本按1:20比例混合，37℃孵育10分鐘后比色。需注意高脂血癥樣本可能產(chǎn)生渾濁干擾，此時(shí)可選用雙縮脲-溴甲酚綠聯(lián)合檢測(cè)法。實(shí)驗(yàn)室常用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品制作校準(zhǔn)曲線(xiàn)。
3. 干擾因素
血紅蛋白、膽紅素等色素物質(zhì)可能影響比色結(jié)果，需作樣本空白對(duì)照。銨離子濃度超過(guò)10mmol/L會(huì)與銅離子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，導(dǎo)致顯色減弱。含EDTA的抗凝血漿會(huì)螯合銅離子，應(yīng)避免使用。某些藥物如磺胺類(lèi)可能產(chǎn)生沉淀，需離心后取上清檢測(cè)。
4. 方法優(yōu)化
自動(dòng)化分析儀采用兩點(diǎn)終點(diǎn)法，在546nm和700nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)消除濁度干擾。微量檢測(cè)可使用96孔板模式，樣本量?jī)H需5μL。為提高靈敏度，可添加表面活性劑如Triton X-100增強(qiáng)顯色穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期驗(yàn)證試劑線(xiàn)性范圍，通常要求r2≥0.995。
該反應(yīng)是蛋白質(zhì)定量金標(biāo)準(zhǔn)，具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉的優(yōu)勢(shì)。實(shí)際應(yīng)用中需結(jié)合樣本類(lèi)型選擇合適前處理方法，異常結(jié)果應(yīng)結(jié)合電泳或免疫檢測(cè)復(fù)核。維護(hù)儀器比色系統(tǒng)的準(zhǔn)確性對(duì)保證檢測(cè)質(zhì)量至關(guān)重要。
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