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關(guān)鍵詞：衰老
除了經(jīng)典的核糖核苷酸A、U、C、G，生物體內(nèi)還有大量的遺傳修飾核苷酸，即所謂的表觀遺傳修飾。它們像籬笆上的燈籠一樣裝飾著RNA，調(diào)節(jié)著基因表達(dá)、mRNA剪接、疾病發(fā)生等各種重要的生命過程。
到目前為止，科學(xué)家已經(jīng)成功鑒定了170多種表觀遺傳修飾，但這些只是冰山一角。為了在轉(zhuǎn)錄組水平實現(xiàn)完整修飾的作圖，自然細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的封面綜述呼吁開發(fā)一種方法來直接定位和定量RNA的所有表觀遺傳修飾。
RNA修飾分析可以通過薄層色譜（TLC）、高效液相色譜-紫外分光光度法（HPLC-UV）或高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）進(jìn)行。這些方法可以同時測量大量的RNA修飾，但很難提供序列信息?；诘诙鷾y序（NGS）的方法可以通過抗體免疫沉淀或化學(xué)修飾來繪制整個轉(zhuǎn)錄組的RNA修飾圖譜。這些方法只能檢測有限種類的修改，并且通常只針對一種特定的修改。仍有大量的RNA修飾無法檢測或定位。
新興的納米孔測序技術(shù)可以直接對長鏈RNA進(jìn)行測序，無需逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，有望直接讀取RNA上所有的修飾信息。然而，由于通道分辨率有限，修飾核苷酸引起的離子電流變化也與其周圍序列有關(guān)，這為準(zhǔn)確判斷修飾的類型和位置以及同時檢測多個修飾帶來了挑戰(zhàn)。
近日，南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院黃碩教授團(tuán)隊發(fā)表了一篇研究論文，題目為：在Nature Nanotechnology中使用工程化納米孔識別核苷單磷酸及其表觀遺傳修飾。
本研究構(gòu)建了一種高分辨率的恥垢分枝桿菌膜蛋白A（MspA）納米孔，可以準(zhǔn)確識別所有經(jīng)典核苷酸及其主要修飾。野生MspA納米孔是天然的八聚體，如何在其中引入獨特的功能位點尚未見報道。
研究團(tuán)隊通過原核共表達(dá)系統(tǒng)成功將一種含半胱氨酸突變的單體引入八聚體，實現(xiàn)了異質(zhì)MspA納米孔的構(gòu)建。然后通過馬來酰亞胺苯硼酸與巰基的邁克爾加成反應(yīng)，進(jìn)一步將唯一的苯硼酸適體引入通道。利用苯硼酸和順式二醇對核苷酸的可逆相互作用，研究團(tuán)隊完全區(qū)分了四種經(jīng)典核苷酸（C、U、A、G），其效果遠(yuǎn)優(yōu)于現(xiàn)有報道，充分證明了非均相MspA通道檢測核苷酸的可行性和高分辨率。
研究團(tuán)隊進(jìn)一步將該方法應(yīng)用于RNA表觀遺傳修飾的檢測，實現(xiàn)了多達(dá)7種常見修飾核苷酸的同時檢測，包括5-甲基胞苷（m5C）、N6-甲基腺苷（m6A）、N7-甲基鳥苷（m7G）、N1-甲基腺苷（m1A）、肌苷（I）等。
這是nanopore首次報道對如此多種核苷酸修飾的直接檢測和完美區(qū)分，充分展示了MspA對微小結(jié)構(gòu)差異甚至修飾異構(gòu)體的優(yōu)異分離度。該方法理論上適用于各種核苷酸、核苷酸修飾和核苷酸衍生物的檢測。
隨后，研究團(tuán)隊開發(fā)了RNA表觀遺傳修飾信號數(shù)據(jù)庫的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，以輔助納米孔事件的自動識別。通過選取每種核苷酸的500個標(biāo)準(zhǔn)事件作為訓(xùn)練集，并對各種機(jī)器學(xué)習(xí)模型進(jìn)行評估，研究團(tuán)隊獲得了最優(yōu)的線性SVM模型。該模型能以99.6%的準(zhǔn)確率區(qū)分11種核苷酸，并能識別混合核苷酸樣品的成分，為真實環(huán)境下的核苷酸檢測提供了自動化數(shù)據(jù)分析工具。
為了直接檢測RNA的修飾，研究小組開發(fā)了一種“拆成幾部分“的方法來檢測天然RNA的完整修飾圖譜。他們利用核酸外切酶將天然RNA消化成單個核苷酸，然后利用高分辨率納米孔檢測和機(jī)器學(xué)習(xí)分析，獲得消化產(chǎn)物中核苷酸的組成和豐度，最終重構(gòu)出原始RNA的序列組成和修飾信息。利用這一策略，研究團(tuán)隊成功檢測到胃腸道腫瘤患者M(jìn)icroRNA中的m5C和m6A修飾，為直接識別microRNA中的表觀遺傳修飾提供了一種快速便捷的單分子分析方法。
為了進(jìn)一步擴(kuò)大該策略的普適性，研究小組將其應(yīng)用于tRNA修飾圖譜的檢測。作為高度修飾RNA的代表，tRNA中已鑒定出90多種修飾類型。以酵母苯丙氨酸t(yī)RNA為例，成熟的酵母苯丙氨酸t(yī)RNA含有11個化學(xué)修飾，包括D、、m5C、m7G、m1A、m22G、m2G、T、Y、Cm和Gm。Cm和Gm不能被苯硼酸修飾的MspA納米孔檢測到，因為它們的結(jié)構(gòu)中缺少順式二醇。通過感知酵母苯丙氨酸t(yī)RNA的消化產(chǎn)物，團(tuán)隊成功繪制了酵母苯丙氨酸t(yī)RNA的修飾圖譜，并確定了其余9個修飾的存在，其豐度與理論結(jié)果基本一致。
該方法無需對RNA消化產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)分離，即可快速定量鑒定天然RNA中已知和未知的修飾，為發(fā)展切割測量的納米孔表觀遺傳測序提供了重要的設(shè)計策略和研究方法。